鹿角生长发育与再生机制研究进展

摘 要 鹿科（Cervidae）动物是反刍动物的一大类群，中国拥有世界上最丰富的鹿科动物种质资源。与其他反刍动物相比，鹿科动物最独特的特点是拥有能够定期再生的器官性骨质角。不同品种的鹿角形态具有较大差异，大部分复杂的大型鹿角主要用于求偶期的争斗，开展鹿角功能与演化的研究对动物遗传学、行为学和生态学有极高价值。鹿角生长发育受多种因素调控，因每年定期再生与快速生长机制，使鹿角成为研究哺乳动物器官再生的理想模型，同时鹿角快速增殖却极少产生癌变的特性也为癌症治疗研究提供了新的视野。有关鹿角生长发育和再生机制的研究近年来取得诸多重要成果，本文对鹿角的生物学特征和初生发育、成熟脱落与再生过程的研究进展进行综述，以期为鹿科动物种质资源保护利用和深入解析鹿角独特性质遗传机制提供理论依据。

关键词：鹿角发育；鹿角再生；骨骼再生机制；鹿科动物

中图分类号：Q958 文献标识码：A 文章编号：2310 - 1490（2024）- 02 - 0421 - 09

DOI：10.12375/ysdwxb.20240223

鹿科（Cervidae）动物归属于鲸偶蹄目（Cetartio⁃dactyla），共有3个亚科，19个属，51种［1］，分布于除南极洲、澳大利亚、非洲中部和南部、马达加斯加以及新西兰外的所有地区［2］。中国是鹿类资源最丰富的国家之一，鹿种占全球的41. 7%［3］。具有再生能力、能够稳定更换的鹿角是鹿科动物特有的标志［4］。大多数哺乳动物的器官或器官附属不具备完整的再生能力，而多数雄性鹿科动物的角作为一个能够稳定再生的骨骼结构器官［5］，是研究哺乳动物长骨发育及器官修复、再生的理想模型。鹿角每年会经历一次生长与脱落的完整过程，在鹿角周期性更替的过程中有两个明显阶段，一个是有茸皮覆盖的鹿角生长阶段（医药学和养鹿业将此阶段的鹿角称为“鹿茸”），另一个是在茸皮脱落后鹿角成为完全的骨角，标志着鹿角成熟的阶段。有茸皮覆盖的鹿角作为传统中药材具有较高的药用价值，其代谢产物中的多种物质被认为与抗衰老和再生机制相关［6−7］。成为完全骨角的成熟鹿角在交配季节中对雄鹿争夺交配权具有决定性作用。但鹿角的发育再生这一动态过程机制尚不明确，本文通过对鹿角生长发育及再生过程研究进展进行综述，旨在讨论鹿角这一独特器官的再生机制。

1 鹿角的特点

鹿是唯一能够长有再生骨质角的动物，除驯鹿（Rangifer tarandus）外，通常仅有雄鹿拥有鹿角。鹿角由角柄处长出，每年脱落与再生，这也是区别于鲸偶蹄目其他动物角最显著的特点［8］。牛角是由永久性的骨质角芯和角质鞘组成，不会发生周期性更换［9］；羚羊（Taurotragus oryx）角骨质部分是被皮肤所覆盖的额骨突起，表皮产生的角质能够每年更换［10］；长颈鹿（Giraffa camelopardalis）角则不包括角质部分，仅包括表皮所覆盖的额骨突起骨质［11］。鹿角只有在生长过程中被皮肤覆盖，鹿角上生长的皮肤才被称为茸皮。茸皮与头部其他区域的皮肤有所不同，茸皮较体表皮肤更厚，且毛囊缺乏立毛肌并拥有丰富的皮脂腺［12−13］。茸皮生长速度与皮下的鹿骨角生长速度保存一致［14］。Wang等［8］对反刍动物头带的比较基因组学的研究发现，鹿角与牛角的基因表达谱相似，角的发育源于相同的神经嵴。此外，有研究发现RXFP2 基因在反刍动物角的发育中有重要作用［15−16］，在不同的反刍动物类群中产生了趋同进化。鹿角是完整的动物器官，在完全骨化前含有皮肤、神经、血管、软骨和骨组织，是“活”的角，区别于由间充质干细胞（mesenchymal stemcell，MSC）分泌的角质所组成“死”的角质角。

鹿角的形状和大小在种间存在巨大差异。鹿角按照形状可分为：无分枝角，如赤麂（Muntiacus vagi⁃nalis）、小麂（M. reevesi）；掌状角，如驯鹿、驼鹿（Alcesalces）；枝状角，如梅花鹿（Cervus nippon）、麋鹿（Elaphurus davidianus）。在现存鹿科动物中，普渡鹿（Pudu puda）的无分枝角长度仅为5～9 cm［17］，成年驼鹿的分叉掌状角则长达108 cm［18］。已知最大的鹿角是已灭绝的巨大角鹿（Megaloceros giganteus）的鹿角，雄性鹿角横宽可达3. 6 m，总质量可达40～45 kg［19］。鹿角的骨骼形式类似于哺乳动物的长骨，和四肢的发育一样，鹿角也有3个轴：近端-远端轴、前后轴和背腹轴［20］。鹿角的力学性质从根部到尖端有所不同，这种变化与骨组织微观结构和矿化的综合效应相关。鹿角骨骼的生成在很短的生长期内完成（4～5个月）［21］，形成的骨骼被茸皮覆盖。茸皮脱落后，其中的血管和神经退化，骨骼形成和矿化停止，鹿角骨骼死亡［22］。

鹿角有分叉，这也是鹿角区别于其他反刍动物角的重要特点。大多数鹿在夏季完成鹿角的骨化并进入求偶期，雄鹿会产生圈群行为，鹿角具有展示以及武器的作用［23］。带有分支的鹿角使雄鹿在求偶期争斗时能够互相锁定和推挤，拥有比其他有角反刍动物更复杂的争斗方式［24］。求偶季节雄鹿激烈的争斗使鹿角容易发生折损，有学者认为，根据缺损的部分进行修补可能比重新按照遗传物质生长成完整的鹿角更加复杂，定期脱落与再生能够保证雄鹿每年拥有完整的鹿角参与求偶过程［25−27］。

2 鹿角的生长发育

鹿角发育始于角柄上的芽基，鹿角柄是额骨上的一个固定突出，成对存在［27］。角柄发育源于眼眶上缘向后内侧延伸的低骨脊后部区域的额顶缝。新生鹿在出生后的第1年，其角柄在睾酮水平上升的刺激下［28］，在角柄上长出芽基，因此，通过对雄性鹿进行早期阉割能够抑制角的生长［29］。新生鹿初始鹿角的形成（通常为无分枝的尖角）是角柄生长的延续，不是角的再生事件。

2. 1 鹿角的新生

鹿角的最初发育依赖于鹿角生长位置上方的额骨附属骨膜，即生茸骨膜（antlerogenic periosteum，AP），将其切除后会阻止鹿角的生长［30］，而将AP自体移植到身体其他部位会导致异位带有茸皮的鹿角生长［31−32］。这些异位鹿角都被特殊的茸皮覆盖，并经历脱落和再生过程。AP不仅在移植部位诱导了鹿角骨生长，还形成了特定的茸皮［30］。同时，试验也表明鹿皮转换为茸皮的能力在鹿的不同部位皮肤中广泛存在［30］。移植试验结果表明，AP细胞在角柄和鹿角形成中起决定性作用［32−33］。哺乳动物额骨是由头部神经嵴细胞分化而来，AP分化过程可能在神经嵴细胞还未迁移或正在迁移时就已完成，或在颅骨生长过程中稍后完成［34］。AP与其他颅盖区域的骨膜相比要厚得多，AP细胞中富含的糖原被认为是快速增殖的能量来源，研究表明其具有胚胎干细胞的特点［35］。此外，AP还携带了鹿角轴向定向形态发生的信息，当AP在原位旋转180°时，随后形成的鹿角显示其前后轴的反转，鹿角形态发生的决定性调控主要存在于AP前内侧部分［30］。通过对鹿和多种反刍动物头带区域转录组及基因组的分析发现，鹿角生长的骨膜早期发育自神经嵴，筛选到的OTOP3 和OLIG1 基因变化可能在反刍动物头带的演化和发育中起关键作用［8］。鉴定到的SNAI2、TWIST1、SOX9 和HOXD 基因，以及其调控元件可能在重编程神经嵴细胞发育成头饰方面发挥作用，而RXFP2 基因在无角的鹿科动物中发生了趋同假基因化［16，36］，因此RXFP2 可能是决定鹿角生长的关键基因［8］。鹿角在早期发育过程中依赖神经、骨骼和皮肤组织的基因募集，对AP来源细胞进行基因编辑发现TGF-β1是鹿角快速生长的调控因子，并且BMP信号通路可能发挥关键作用［37−38］。另外一项对比小鼠和鹿软骨细胞的研究发现，鹿TGF-β1和小鼠TGF-β1蛋白存在结构差异，且鹿TGF-β1可能比小鼠TGF-β1具有更强的功能［39］。

在外观上，在第1对鹿角形成过程中，角柄处皮肤变成鹿茸皮是可见的转化过程［22］。鹿角再生的初始时期，脱落的角柄残留部分皮肤伤口会产生无疤痕的再生性愈合［40］，研究认为这个过程中机械压力的变化是诱导这一过程产生的原因［14］。在鹿皮变化为茸皮的过程中，毛囊立毛肌和汗腺会退化，大型双叶或多叶皮脂腺会增加，这种变化是皮肤对周期性激素水平诱导信号的特定反应。茸皮下层的MSC来源于鹿角柄处的骨膜［41］，茸皮进入快速生长阶段后面积不断扩大，当茸皮与鹿皮的边界移动到角柄基部时，标志着鹿角柄的成熟和角生长的正式开始，茸皮被激活与鹿茸芽基的再生是一个同步的过程［42−43］。

2. 2 鹿角的发育成熟

鹿角生长速度极快，马鹿（Cervus elaphus）角平均生长速度为1. 7 cm/d［28］，加拿大马鹿（C. canaden⁃sis）角最快生长速度可达2. 75 cm/d，而已灭绝的巨大角鹿可能拥有更快的鹿角生长速度［44］。每年重新生成鹿角需要补充大量的钙磷，而在鹿角快速生长期仅通过食物摄入矿物质无法满足角生长的钙磷需求［45］。研究显示，在鹿角快速生长时期会发生类似于雌性哺乳期动物的骨质动员现象，会在肋骨等部位发生骨吸收，使鹿产生周期性的骨质疏松。这种全身钙磷的动员可能是影响鹿角大小的主要因素［26］。

鹿角成熟是软骨内骨化的结果［46］。对不同鹿科物种未成熟初生鹿角和再生鹿角的组织学结构以及正在发育的鹿角骨化过程进行研究，结果表明鹿角生长是持续性的［47−48］，而哺乳动物长骨生长的特征，如生长板和次生骨化中心在生长的鹿角中并不存在［49］。鹿角属于顶端生长，在不同区段之间有逐渐过渡的不明确边界［40］。远心端的鹿角部分比近心端的年轻，成熟鹿角纵向轴上的组织结构［50］可以证明这一特点。另外，对不同区段鹿角蛋白质组学的分析发现，鹿角尖端表达的蛋白质主要与抗氧化代谢机制、蛋白质形成和Wnt信号通路有关，鹿角中段表达的蛋白质与血液有关［51］。位于茸皮真皮层下面的是软骨膜，由大量低分化程度细胞组成，也被称为增生软骨膜，其与鹿角周围的鹿角骨膜细胞（antlerperiosteal cells，AnPC）相连，鹿角软骨细胞在AnPC膜内实现骨化［32］。细胞体外培养试验证明，鹿角尖端MSC增殖受Ras/Raf、MEK/ERK通路调节，并通过Gab1/Grb2和PI3K/AKT通路调节细胞的迁移［52］。软骨膜下方致密细胞层被称为增殖带，即增生区，其从远端到近端依次细分为3个亚区，即储备间充质、前软骨层和软骨层［15］，后2个亚区也被称为软骨前区。储备间充质的特点是有丝分裂活性高，细胞凋亡水平高，存在丰富神经血管网络［53］。紧随其后的是软骨细胞或软骨区，由透明软骨组成，在该区域内，软骨细胞经历成熟和肥大，且软骨基质开始矿化［54］。

在软骨前区，细胞经历了软骨分化的第1个步骤［48］，在软骨前区中特异性高表达的基因主要与Wnt通路相关［38］，该信号通路可能参与干细胞向软骨形成的早期分化，OPN 基因受启动子DNA甲基化水平的调控，主要通过调控软骨前组织和软骨组织的生长来促进鹿角早期生长发育［55］。比较前软骨层和软骨层细胞DNA 甲基化水平的研究也显示，软骨细胞的DNA甲基化水平明显更高，这表明DNA去甲基化可能参与了鹿角快速软骨分化［56］。软骨区也含有许多血管。在软骨层中高表达的基因与软骨发育（如SOX6 和SOX9）以及细胞外基质组织生长发育（如COL2A1）有关［57］。肥大软骨层中高表达的基因，如MMP16 与软骨细胞矿化有关［58］。该区域内软骨细胞排列成相互连接的垂直小梁，形成一个围绕富含血管化梁间组织的空间网络［53］。软骨的骨化从小梁中央向外围扩散。在接近软骨区的位置，存在一个具有软骨吸收、骨吸收和成骨活性共存的广泛区域，呈现出海绵状特征。在这个区域内，软骨被大量软骨吸收细胞侵蚀，骨组织沉积在变薄的软骨小梁表面［59］。随着软骨吸收和成骨化，软骨网络被完全矿化，骨小梁系统逐渐被替代。在某些部位，新形成的骨组织也被骨吸收细胞侵蚀［60］，尤其是在鹿角远端位置，软骨在被替代过程中并未完全被吸收，这些组织残留物可以在坚硬的鹿角骨小梁中央被找到［61］。在鹿角四周，骨化结构逐渐沉积并压实，形成一个紧密的表面，环绕内部松质部分。鹿角骨化过程还包括软骨周围的钙化。因此，沿着鹿角外缘，通过直接从软骨周围或骨膜（鹿角顶端）骨化而形成了一个光滑骨套［62］。这一过程可能也是形成某些鹿种鹿角表面特征突起的原因［63］。鹿角生长随睾酮水平的升高而终止，在茸皮脱落时血液流动停止，骨骼形成和矿化停止，形成成熟的骨质角［21］。

3 鹿角的脱落再生

鹿角在茸皮脱落前后，其中的血管神经逐渐退化成硬骨角，在交配季节过后鹿角自然脱落，第2年开始在角柄上长出新的鹿茸角，即鹿角的再生。关于鹿角的周期性脱落与再生的原因有多种猜测，如发育期的鹿角神经血管丰富不适于打斗，成熟已死亡的鹿角无法对在发情期争斗中出现的骨折进行自我修复，而定期的鹿角再生能确保雄鹿每个发情季节都有一套全新的“武器”。再如初生鹿角通常只有简单的无分叉结构，随着每年鹿角的脱落和再生，随后生长的鹿角尺寸和复杂性才有可能增加［23］。也有观点认为，鹿可能发源于温带，富含神经血管且表面积较大，有永久性皮肤覆盖的鹿角很容易被冻坏，定期的再生有利于每年保存完整的鹿角［64−65］。

3. 1 鹿角的骨化与脱落

雄性鹿的鹿角再生周期与它们的繁殖周期密切相关，栖息在较高纬度的鹿科物种，其生殖周期受光周期的严格控制［66−67］。鹿角的生长启动发生在睾酮水平较低的阶段［68］。求偶期前睾酮浓度的增加导致鹿角迅速骨化并伴随茸皮脱落，有研究认为CALR 基因很可能是雄性激素触发鹿角再生的下游介质［69］。早期鹿角生长中主要的营养供应来源于鹿角柄处及鹿角根部的血管，随着鹿角的快速生长，远端鹿角主要依靠茸皮丰富的血管网络提供营养［70］。茸皮脱落导致位于茸皮中的血管无法继续为鹿角提供营养，鹿角内部的血管也逐渐死亡，最终导致裸露骨质鹿角的死亡［25］。随后，在求偶期间，裸露的骨质鹿角被用于雄性之间的求偶争斗。

发情期过后，循环睾酮水平下降，引发角柄骨膜（pedicle periosteum，PP）附近的破骨细胞骨吸收［59］，破骨细胞再吸收也发生在骨柄的骨膜表面，导致角柄上方环状沟的形成［60］。这两个过程导致角柄和鹿角之间的连接逐渐减弱，最后导致鹿角从角柄上断裂［71］，形成新的鹿角在鹿角柄上开始以年为周期的脱落和再生过程［72］。有证据表明，在鹿角局部睾酮转化为雌激素后会影响鹿角的生长发育，注射雌激素会抑制再生鹿角的生长，而促进鹿角过早骨化和茸皮脱落［73］。睾酮对鹿角的影响在某种程度上是间接的［30］。

3. 2 鹿角的再生

鹿角脱落后，会在角柄残基顶部发生短暂的膜内成骨［74］，弥补了之前部分角柄骨的缺失［40，75］。尽管PP会发生骨质修复，但是随着鹿年龄的增大，PP会逐渐变薄，由于角柄基部会发生骨质堆积，因此在鹿的整个生命周期中，骨柄厚度在增加［76］。鹿角脱落时伴随着角柄附近血管的断裂，但之后伤口表面迅速被皮肤覆盖，皮肤下面形成了一团再生组织，即鹿茸芽［76］。鹿茸芽在角柄残端顶部形成一个再生芽状物，此过程类似于其他脊椎动物附肢的表皮再生过程。在鹿角再生期间，鹿角最下方的分叉很早就开始发育，在鹿茸芽中已经可以识别出主梁和眉叉的分别增殖区域［77］，都位于鹿角中央部位，是鹿角的生长中心［74］。在多叉鹿角再生过程中，主梁尖端的生长中心反复不对称地分裂为一个较大的生长中心成为主梁，以及一个较小的生长中心用于长出相应的分叉角［78］。

鹿角再生是一个基于干细胞再生不依赖于去分化的周期性激活过程［41］。PP是负责启动鹿角柄和第1个鹿角生长AP的衍生物［76］。有研究表明，AP和PP细胞具有干细胞属性［69］。来自AP、PP和鹿角生长中心的细胞统称为鹿角干细胞（antler stem cells，ASCs），ASCs是鹿角再生的基础，其可在体外被诱导分化为软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞［79］。通过对分离自鹿角不同位置的ASCs、AnPC和PP细胞进行体外培养，发现培养的AnPC表达经典的MSC标记物，与PP细胞一致。然而，AnPC上的MSC标记物强度明显弱于PP。AnPC的增殖率在连续传代后逐渐降低，而PP细胞的增殖率保持不变，与PP细胞相比，AnPC的分化程度更高。全基因分析也揭示了两者基因表达模式的不同。鹿角再生过程中，AnPC主要起促进血管生成、神经生长和骨膜内骨形成的作用，PP 则可能主要参与雄激素信号受体途径和PI3K/AKT信号通路，起干细胞更新的作用［32］。另一项对鹿角再生的研究利用单细胞测序技术建立了鹿角再生的时空细胞图谱，从鹿角尖部分离鉴定出了鹿角芽基祖细胞（antler blastema progenitor cells，AB⁃PCs），这类细胞能够直接促进鹿角再生，相比人类骨髓干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），其有更强的自我更新能力，以及更显著的成软骨和成骨的能力［57］。鹿角的快速细胞增殖需要刺激细胞快速增殖的因子，以及ABPCs的干细胞特性控制细胞周期。ABPCs 高度表达的标记基因PRRX1、TNC、DLX5、PTN 和SOX4 在小鼠长骨快速发育中也存在，这些基因可能在哺乳动物骨骼发育中起到重要作用且具有物种间的保守性［57］。在ABPCs 中检测到的大量与血管合成相关的基因也符合鹿角软骨血管高度密集的特征［70，80］，证明ABPCs在鹿角再生过程中起到多种作用。此外，ABPCs样细胞也存在于处于再生过程中的哺乳动物器官中，但不存在于哺乳动物非再生组织，也不存在于蝾螈（Ambystoma mexicanum）和斑马鱼（Danio rerio）的再生组织中，这提示哺乳动物与其他非哺乳动物存在不同的再生机制，而ABPCs或许在哺乳动物的附肢再生中发挥重要作用［48］。在ASCs中添加褪黑素（melatonin，MLT）能够加速干细胞分化，并且MLT通过MT2结合介导YAP1 的转录来调节Col1a 的表达，MLT通过抑制STAT5/IL-6信号通路激活依赖于SOX9 表达的AKT/CREB通路，能够有效抑制血管内皮生长因子（vascular endothelialderivedgrowth factor，VEGF）诱导的鹿角软骨细胞变性［81］。目前对于鹿角再生过程中多种ASCs的研究主要集中于寻找启动再生的细胞类群，而对于不同类群细胞协同参与，相关分子机制的验证以及在临床上的应用还有待进一步探索。

鹿角再生过程中涉及的各类干细胞研究对于临床上的骨骼修复和恒牙再造领域有极高的应用前景。ABPCs特异表达相关基因的研究也有助于加深对干细胞的认识，ABPCs可能在骨损伤或肢体再生的再生医学中被利用。

4 结语及展望

鹿角周期性再生是哺乳动物器官再生的典型案例，是研究骨骼、神经和血管损伤再生的理想模型。鹿角再生过程不同于两栖类动物的去分化再生过程，它是一种周期性干细胞控制的重生长［80］。茸皮无疤痕修复机制对于疤痕修复、皮肤再生研究也有很重要的研究意义。另外，鹿角在快速增长过程中很少发生癌变［53］，其具体机制有助于理解癌症的发生和研究抑制、治疗癌症的手段。我国拥有丰富的鹿种资源，研究鹿角这种独特的器官对于保护我国鹿种资源具有重要作用。随着组学技术的快速发展，通过宏基因组研究鹿对钙磷的消化代谢，可为牛羊等反刍动物的饲料营养研究提供新的观点；基于单细胞测序技术、空间转录组测序技术等新手段对鹿角生长发育机制进行研究，对于理解再生医学有重大意义，尤其是可为人类四肢的断肢修复治疗提供重要思路［20］。

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基金项目：北京市财政资金项目（23CB063）