做 WB 你最容易忽略的几个细节，我们找出来了

图 1：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（上）或 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（下），对未经处理或经 LY294002/Wortmannin 处理的 PC-3 细胞、经血清饥饿或 PDGF 处理的 NIH/3T3 细胞提取物进行蛋白质印迹分析。

如何选择阳性对照？

a. 总蛋白的阳性对照

选用明确表达该蛋白的细胞或组织样本；可参考说明书示例图或数据库。如下图所示，Saos-2 细胞高表达 RUNX2，适宜作为阳性对照样本，而 LNCaP 细胞不表达该靶标。

图 2：使用 RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb #12556 和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457， 对 Saos-2 和 LNCaP 细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

b. 翻译后修饰蛋白的阳性对照

并非所有的细胞都有基础的翻译后修饰水平（如磷酸化）的表达。如图 3 所示，不同的细胞 p-AKT(Ser473) 的基础水平差别非常大。有些靶标需要合适的刺激条件（包括诱导因子、剂量和时间窗）使蛋白获得修饰。您可查看说明书、阳性对照处理表，或者通过广泛阅读文献，了解处理方式，并结合预实验摸索条件。

图 3：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 检测不同样本中靶标的表达。

2）裂解样本用什么裂解液？

选择裂解液的考虑因素为样本种类：细胞，组织还是分离出的细胞组分。

对于全细胞裂解，建议使用 Cell Lysis Buffer（#9803）、RIPA 缓冲液（#9806）或 SDS 上样缓冲液 (#7722)。Cell Lysis Buffer 由于不含会使蛋白变性的强力去垢剂，仅含 1%Triton，使其可在多种实验中被使用（如 WB、IP）。RIPA 缓冲液含有 NP40 和脱氧胆酸钠，变性能力更强，可以裂解细胞或者组织。SDS 上样缓冲液也可以裂解细胞样本，但会干扰后续的 BCA 测定。

使用裂解液裂解时，需提前加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，以抑制内源性蛋白酶对细胞蛋白的降解和磷酸酶的去磷酸化作用。阅读裂解液说明书，来明确是否需要额外添加蛋白酶抑制剂（PMSF #8553 或 Protease Inhibitor Cocktail #5871）或者磷酸酶抑制剂（Phosphatase Inhibitor Cocktail #5870）。对于 Cell Lysis Buffer（#9803）、RIPA 缓冲液（#9806），仅需补充 PMSF 即可。

对于细胞组分分离，则可以通过组分分离试剂盒完成。Cell Fractionation Kit #9038 可方便快速的分离细胞组分用于下游分析，通过移液和离心的方式，分步获得细胞组分（图 4）。

Cell Fractionation Kit #9038 中缓冲液及功能:

目的

缓冲液

分离胞浆

Cytoplasmic Isolation Buffer (CIB)

分离膜

Membrane Isolation Buffer (MIB)

分离骨架和核

Cytoskeletal/Nuclear Isolation Buffer (CyNIB)

图 4：使用 Cell Fractionation Kit #9038，对 HeLa 细胞的细胞组分进行蛋白质印迹分析，结果表明蛋白在细胞浆、细胞器/膜以及胞核/细胞骨架的定位。全细胞裂解物 (WCL) 表示总蛋白。细胞浆蛋白 (Cyto) 使用 CIB 缓冲液进行分离。膜和细胞器蛋白 (Mem) 使用 MIB 缓冲液进行分离。胞核和细胞骨架蛋白 (Nuc) 使用 CyNIB 缓冲液分离。

3）裂解后是否需要超声？

样本裂解后，建议进行超声。超声可以破坏膜结构，断裂 DNA，降低样本的粘稠度，让样本更加均质化，增加蛋白的溶解，提高实验结果的一致性。对于核蛋白或者膜相关蛋白，超声步骤尤为重要 (图 5)。

超声步骤为冰上 3 次 5 秒的超声（50% 输出功率），控制超声探头位置，避免产生气泡。如没有超声仪，可用 1 mL 注射器针头，冰上反复抽打裂解液 5~10 次，达到类似于超声的效果。

图 5：使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody#9701 对超声或者未经超声处理的细胞裂解液进行检测

4）封闭：BSA 还是奶粉？

封闭的目的是减少由一抗或二抗的非特异性结合引起的背景。BSA 仅含有一种蛋白质，分子量为 60KD。而奶粉则含有多种蛋白质，所以封闭作用更佳（图 6）。

有文章指出奶粉中的磷酸酶可影响磷酸化信号，那磷酸化蛋白还能用牛奶吗？我们的回答：是的。二十余年的磷酸化蛋白抗体研发经验告诉我们，新鲜配置的牛奶不会对磷酸化信号产生任何影响，但随着牛奶储存时间的延长（即便在 4 ℃），就可能使磷酸化信号下降。且牛奶封闭更加全面，使得磷酸化靶标识别特异性更佳。

图 6：使用 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb #13038，检测经 PDGF 处理的 3T3 细胞样本，BSA 封闭的结果中可见背景和杂带，而牛奶封闭的结果背景更干净，信号强且清晰。

封闭时使用 5% 脱脂奶粉-TBST，摇床上室温封闭 1 h。如后续使用荧光发光法，则封闭时不可含有 Tween® 20。二抗孵育时，也推荐用 5% 脱脂奶粉-TBST 稀释二抗，降低背景。注意，需使用实验级脱脂奶粉（Nonfat Dry Milk #9999），食品级奶粉不可用于实验。

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仅供研究使用。不得用于诊断流程。

图文来源：CST

题图来源：站酷海洛

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